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β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性檢測試劑盒說明書

提 供 商: 上海研謹生物科技有限公司 資料大?。?/td>
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β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性檢測試劑盒說明書

注意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

規(guī)格:100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。


微量法


試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 12mL 雙蒸水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。

標準品:液體 1mL×1 支,5μmol/mL 的對硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說明:

β-GC(EC 3.2.1.21)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化β-糖苷鍵水解,具有多方面生理作用:在纖維素的糖化作用中,β-GC 負責進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖;β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體,使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味;β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷,釋放 HCN,從而防止昆蟲取食。

β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性。

試驗中所需的儀器和試劑:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟:

一、粗酶液提?。?/p>

1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每 1000 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率 20%,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次),15000g, 4℃,離心 20min,取上清,置冰上待測。

2、組織的處理:稱取約 0.2g 組織,加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿;15000g,4℃,離心 20min,取上清,置冰上待測。

3、標準樣品的準備:取 100μL 標準液,加入到 400μL 試劑三中,得到 1μmol/mL 標準液,十倍稀釋到 100nmol/mL,用蒸餾水倍比稀釋:50、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做標準液。

二、測定步驟

1.分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 400nm,蒸餾水調(diào)零。


2.加樣表

試劑名稱(μL)測定管對照管標準管

試劑一120

試劑二150150

樣本3030

充分混勻,放入 37℃準確水浴 30min 后,立即放入沸水浴中煮沸 5min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)


充分混勻,8000g,4℃,離心 5min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑)




充分混勻,室溫靜置 2min 后,400nm 處測定吸光值 A,計算ΔA=A 測定管-A 對照管。三、β-GC 活力計算:

1、標準曲線建立:根據(jù)標準管的濃度(y)和吸光度(減去濃度為 0 標準管的 OD 值,x),建立標準曲線。

2、根據(jù)標準曲線,將ΔA(x)帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度(nmol/mL)。

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每 g 組織在每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W

(3)按細菌或細胞數(shù)量計算:

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y

Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品鮮重,g;1000:細胞或細菌總數(shù),1000 萬;T:反應時間,0.5h。

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